Ar-ge

Giriş

İnfertilite gözlenen ailelerde, olguların hemen hemen yarısında, erkekten kaynaklanan bir faktörün etkili olduğu ve Y kromozomu erkek fertilitesi için gereklidir.

Azospermi (sperm üretiminin olmayışı) olgusu gösteren erkeklerde ve bunların fertil babalarında yapılan karşılaştırmalı sitogenetik çalışmalar sonucunda, Y kromozomunun q kolunda (Yq11) yer alan 4 bölgede (AZFa, AZFb, AZFc ve AZFd) meydana gelen delesyonların infertiliteden sorumlu olduğu belirlenmiş ve AZOSPERMİ FAKTÖRLERİ olarak tanımlanan bu bölgelerde meydana gelen delesyonlar, erkeklerde infertilite sebebidir.

Y kromozomu mikrodelesyonlarının belirlenmesi ve analizi, erkek infertilitesi çalışmalarında önemli rol oynar. PCR’ ın keşfiyle ve Y kromozomunda STS bölgelerinin mikrodelesyonlarının tanımlanması ile, hastalarda AZF bölgesinin belirlenmesi sağlanmıştır.

AZOplex IV kiti,  tüm AZF bölgelerindeki 14 adet STS’ nin belirlenmesinde kullanılır. 14 farklı primer dizisi 4 grupta bir araya getirilmiştir.  Tek bir PCR protokolü kullanılarak tüm 14 hedef bölgenin varlığı ya da yokluğu, multipleks PCR amplifikasyonu  ile belirlenmektedir.

Tablo. PCR miksleri, her tüpteki STS bölgeleri ve elde edilen PCR ürünleri

Kit İçeriği

- Tüp A (400 µl) AZF PCR karışımı A (enzim içerir)

(saklama şartı; +4 +8 ^oC)

-Tüp B (400 µl) AZF PCR karışımı B (enzim içerir) (saklama şartı; +4 +8 ^oC)

- Tüp C (400 µl) AZF PCR karışımı C (enzim içerir) (saklama şartı; +4 +8 ^oC)

-Tüp D (400 µl) AZF PCR karışımı D (enzim içerir)

(saklama şartı; +4 +8 ^oC)

Uyarılar

1) Bu kit sadece laboratuvar çalışmaları için üretilmiştir.

2) Raf ömrü geçen ürünleri kullanmayınız.

3) Bu kit sadece uygun laboratuvar ekipmanı ve deneyimli kullanıcılar tarafından kullanıldığında optimum sonuç verir.

4) Hasta örnekleri potansiyel enfeksiyon kaynağı olarak düşünülmeli ve belirlenen risk faktörleri için gerekli önlemler alınmalıdır.

5) Kit reaktiflerini hasta DNA örnekleri ve PCR ürünlerinden ayrı saklayınız.

Gerekli Materyaller 

- DNA örnekleri (konsantrasyonu 20 ng/µl olan Tris tamponu veya distile suda çözdürülmüş genomic DNA kullanınız)

- İnce duvarlı PCR tüpleri (0.2 ml).

Test Prensibi

AZOpleks IV AZF kitinde yer alan her PCR miksi ile, hedeflenen STS bölgeleri spesifik olarak amplifiye edilir. PCR ürünleri agaroz jel elektroforezi ile görüntülenir.

-       Wild tip (normal) STS dizileri tabloda belirtilen farklı baz büyüklüklerine göre aşağıdaki jel paterninde görüldüğü gibi spesifik bant verir.

-       İlgili STS dizilerinde delesyon söz konusu ise jel paterninde o diziye spesifik bant görülmez.

-       Bu protokolde tanımlanan jel paterni örnek DNA’ lardan elde edilecek jel paternlerine bir referans olarak verilmiştir.

Bu kit Applied Biosystem 2720 Model Thermal Cycler kullanılarak optimize edilmiştir.

1         2        3        4        5         6         7         8       9 

1-4. sıra; Normal erkek PCR ürünleri (Mix-A, Mix-B, Mix-C ve Mix-D)

5. sıra; 100 bp DNA ladder.

6-9. sıra; Bayan PCR ürünleri (Mix-A, Mix-B, Mix-C ve Mix-D), sadece kontrol bantları görülmektdedir. 

Protokol

DNA örnekleri standart işlemlere göre hazırlanır.

Dört adet 0,2 ml PCR tüpü aşağıdaki gibi tüp A, tüp B, tüp C ve tüp D olarak belirlenir;

Tüp 1’ den Tüp 4’ e kadar aşağıdaki işlemler yapılır; 

1) - Tüp A (kırmızı kapak)’ dan 13 µl Tüp 1’ e

- Tüp B (mavi kapak)’ dan 13 µl Tüp 2’ ye

- Tüp C (yeşil kapak)’ dan 13 µl Tüp 3’ e

- Tüp D (sarı kapak)’ dan 13 µl Tüp 4’ e

2) 2 µl  DNA örneği

3) 0.15 µl Taq polymerase (beyaz kapak)

PCR Şartları:

1) Denaturation    :94 ^oC - 15 dk

2) Denaturation    :94 ^oC - 15 sn

Annealing         :61^oC – 30 sn          10 döngü

Extension          :72 ^oC - 45 sn

3) Denaturation    :94 ^oC - 15 sn

Annealing         :59 ^oC - 30 sn           25 döngü

Extension          :72 ^oC – 45 sn

4) Extension         :72 ^oC - 4 dk

5) Hold                 : 4 ^oC sınırsız

PCR Ürünlerinin Analizi

PCR ürünleri %1.5-2’ lik agaroz jelde yürütülerek görüntülenir.

Elde edilen jel paterninde kontrol bantlarının tümü olmalıdır. Aksi halde PCR şartlarında problem vardır ve çalışma tekrarlanır. Kontrol bantları var ise, her kuyucuktaki STS bantlarının varlığı ya da yokluğuna göre sonuca gidilir.